Presentation Information
[P-90]Interaction between TGF-β and non-collagenous proteins in bone extracts
*Keisuke Kohri1,2, Mai Shirai1, Chikahiro Ohkubo1 (1. Department of Oral Rehabilitation and Prosthodontics, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tsurumi University School of Dental Medicine)
【目的】
抜歯後の歯槽骨吸収はインプラント治療の大きな臨床課題であり，様々な骨造成術が用いられている．骨再生の促進に成長因子は重要な要素であり，効果的な成長因子の臨床応用が望まれている．先行研究により，ラット大腿骨由来の脱灰骨シートが骨再生を促進し，その効果に骨由来タンパク質の関与が示唆されている．本研究では，骨基質に存在し，骨造成に関与する生理活性物質と相互作用する非コラーゲン性タンパク質(NCP)を同定することを目的とした．
【方法】
6週齢SDラットの大腿骨より骨粉を調製し，塩酸グアニジン(G1画分)，塩酸・ギ酸(H画分)，再度塩酸グアニジン(G2画分)による連続抽出を行った．H画分は低圧イオン交換クロマトグラフィー(IEX)により4画分(IE-a～IE-d)に分離した．各画分のトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)様活性は，ヒト歯根膜細胞を用いたアルカリホスファターゼ(ALP)活性測定により評価した．電気泳動後，Stains-All(SA)染色陽性の主要NCPバンドについて質量分析を行った．またIE-d画分について，PAI1プロモーターを用いたDual-Luciferase Reporter (DLR)アッセイを実施し，TGF-β活性を検証した．加えて，IE-d画分をイオン交換高速液体クロマトグラフィー (IE-HPLC)により分画し，酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)によりTGF-β1およびオステオポンチン(OPN)を検出した．さらに，異種抗体サンドイッチELISAによりOPN-TGF-β1結合能を評価した．
【結果と考察】
ALP活性測定により，G1，H，G2のすべての画分にTGF-β様活性が認められた．SA染色により酸性NCPを豊富に含むH画分に着目したところ，60 kDaおよび64 kDaの主要NCPは，質量分析によりOPNと同定された．IEXにより，OPNはIE-d画分に分離され，ALP活性測定およびDLRアッセイから同画分にTGF-βの存在が示唆された．さらにIE-HPLCにより60 kDaおよび64 kDa のOPNが分離され，異種抗体サンドイッチELISAの結果，両OPNはいずれもTGF-β1と結合した複合体を形成していることが明らかとなった．以上より，骨基質中においてOPNがTGF-β1と複合体を形成し，骨造成に関与する可能性が示唆された．
抜歯後の歯槽骨吸収はインプラント治療の大きな臨床課題であり，様々な骨造成術が用いられている．骨再生の促進に成長因子は重要な要素であり，効果的な成長因子の臨床応用が望まれている．先行研究により，ラット大腿骨由来の脱灰骨シートが骨再生を促進し，その効果に骨由来タンパク質の関与が示唆されている．本研究では，骨基質に存在し，骨造成に関与する生理活性物質と相互作用する非コラーゲン性タンパク質(NCP)を同定することを目的とした．
【方法】
6週齢SDラットの大腿骨より骨粉を調製し，塩酸グアニジン(G1画分)，塩酸・ギ酸(H画分)，再度塩酸グアニジン(G2画分)による連続抽出を行った．H画分は低圧イオン交換クロマトグラフィー(IEX)により4画分(IE-a～IE-d)に分離した．各画分のトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)様活性は，ヒト歯根膜細胞を用いたアルカリホスファターゼ(ALP)活性測定により評価した．電気泳動後，Stains-All(SA)染色陽性の主要NCPバンドについて質量分析を行った．またIE-d画分について，PAI1プロモーターを用いたDual-Luciferase Reporter (DLR)アッセイを実施し，TGF-β活性を検証した．加えて，IE-d画分をイオン交換高速液体クロマトグラフィー (IE-HPLC)により分画し，酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)によりTGF-β1およびオステオポンチン(OPN)を検出した．さらに，異種抗体サンドイッチELISAによりOPN-TGF-β1結合能を評価した．
【結果と考察】
ALP活性測定により，G1，H，G2のすべての画分にTGF-β様活性が認められた．SA染色により酸性NCPを豊富に含むH画分に着目したところ，60 kDaおよび64 kDaの主要NCPは，質量分析によりOPNと同定された．IEXにより，OPNはIE-d画分に分離され，ALP活性測定およびDLRアッセイから同画分にTGF-βの存在が示唆された．さらにIE-HPLCにより60 kDaおよび64 kDa のOPNが分離され，異種抗体サンドイッチELISAの結果，両OPNはいずれもTGF-β1と結合した複合体を形成していることが明らかとなった．以上より，骨基質中においてOPNがTGF-β1と複合体を形成し，骨造成に関与する可能性が示唆された．